Transfección

En sentido amplio, la transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos, vectores víricos u otras herramientas para la transferencia. En un sentido más reducido, frecuentemente se usa solo para referirse a la introducción de material genético en células animales, prefiriéndose otros términos para otras células (ver Origen del término y relación con otros términos).

Transfección por Aggrobacterium

La transfección de células animales generalmente se lleva a cabo abriendo poros o "agujeros" transitorios en la membrana plasmática de las células mediante electroporación, para permitir el paso del material genético (como construcciones de DNA superenrollado o siRNA) aunque pueden ser transfectadas incluso proteínas (como anticuerpos, por ejemplo). Además de la electroporación, se pueden utilizar otras técnicas para efectuar la transfección, como por ejemplo liposomas producidos mediante la mezcla de lípidos catiónicos con el material genético, que se fusionarán con la membrana plasmática celular y depositarán su carga adentro.

Origen del término y relación con otros términos

El significado original de "transfección" era "infección por transformación", es decir, introducción de DNA o RNA desde un virus procariótico ó bacteriófago en las células, resultando en una infección. Al tener el término transformación otro sentido en biología celular animal (un cambio genético que permite la propagación durante largos periodos de células en cultivo, o la adquisición de propiedades típicas de las células cancerígenas), el término transfección adquirió, para células animales, su actual significado de cambio en las propiedades celulares por la introducción de material genética.[1]

Actualmente, se recomienda emplear la siguiente terminología:

Métodos empleados

Métodos Químicos[3]

Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorpora, ya sea directo mediante la ruta endocítica o a las membranas.

Métodos Físicos[1]

Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula.

Métodos Biológicos [5]

Basados en procesos naturales, aunque a menudo con eficiencia mejorada mediante técnicas de laboratorio:

transfección de microorganismos

Transfección estable y transitoria

Transfección estable

Para la generación de líneas celulares estables el transgen de interés debe ser co-transfectado con un marcador de selección que produzca resistencia a una droga. Para cada ensayo de transfección estable se debe monitorear de manera cuidadosa la integración del transgen en el genoma de la célula blanco. El método más utilizado en la investigación clínica para lograr una transfección estable es el de la transfección mediada por virus, también conocida como transducción. Este método es altamente eficiente debido a la naturaleza viral de la integración en el genoma del huésped. Por ejemplo, se ha utilizado el virus de la leucemia murine (MLV) como vector viral para establecer la expresión sostenible de genes de interés en humanos. El MLV integra su DNA en el genoma del hospedero, el cual es posteriormente expresado. El DNA del MLV integrado se replica con el genoma del hospedero, lo que permite la expresión sostenible del gen de interés.[6]

En un experimento de transfección típico se debe permitir a las células recuperarse de la transfección por un periodo de 24 a 72 horas en la ausencia de selección. Esto permite a la célula expresar la cantidad necesaria de la enzima de resistencia para proteger a las células transfectadas establemente contra la droga. Después de 48 o 72 horas de la transfección el medio de cultivo debe ser cambiado y reemplazado con medio nuevo complementado con la droga. La selección se produce dentro de las primera a las tercera semana posterior a la transfección con cambios frecuentes del medio de cultivo selectivo. Finalmente la integridad y número de copias del gen debe ser determinado por Southern Blot.[7]

Transfección transitoria

La transfección transitoria de genes está sujeta a varios parámetros. El método de transfección, la fisiología celular, el método enzimático o colorimétrico utilizado para cuantificar la actividad del gen reportero, la cantidad de DNA y la normalización de la data. El período de expresión del gen en una transfección génica que varía entre 24 a 72 horas y para el éxito del procedimiento son críticas las condiciones celulares, con las células saludables y las que se encuentren en división las más susceptibles a aceptar plásmidos recombinantes. Para determinar la eficiencia y reproducibilidad de la transfección se puede utilizar un segundo gen reportero que exprese un producto génico que pueda ser detectado y medido de manera sencilla. Tal gen reportero no debe estar presente en el genoma del tipo celular o, en el peor de los casos, puede estar presente pero debe ser expresado en bajos niveles. Es importante recalcar que la eficiencia en la expresión del gen reportero disminuye drásticamente con la integridad del plásmido y su habilidad por llegar al núcleo. Los métodos de transfección transitoria generalmente dirigen el DNA plasmático al citoplasma y no está claro qué porcentaje de estas moléculas son lineales o circulares los alcanzan el núcleo celular. Además, los parámetros experimentales deben ser definidos con cuidado para lograr cierto grado de reproducibilidad. Se ha sugerido que entre los diferentes mecanismos, la difusión pasiva de los plásmidos a través del citoplasma y los poros nucleares representa la forma más probable por la cual los genes reporteros pueden migrar al núcleo celular y ser activados transcripcionalmente. Sin embargo, existe evidencia que sugiere otro mecanismo para explicar la transferencia del DNA plasmático al núcleo celular, basándose en señales de importación del DNA. Se piensa que existe una interacción proteína-DNA plasmático en el citoplasma y que tales interacciones, con factores de transcripción producen señales de localización nuclear, permitiendo la importación de DNA exógeno al núcleo.[8]

Interés biológico de la Transfección

La aplicación más común es su uso en transgénesis. También es muy empleado en investigación básica para estudiar la genética de los organismos y su respuesta ante ciertos cambios.[6] Otro uso es el rescate de marcadores empleado para estudiar la genética de los bacteriófagos; esta técnica consiste en adicionar a un cultivo bacteriano competente un bacteriófago con una mutación en su genoma, y después de su adsorción del DNA fágico añadir al cultivo DNA transfectante procedente de un bacteriófago silvestre. De este modo los genomas de los fagos silvestres de la descendencia provendrán de la recombinación de los dos DNA víricos.

Se ha demostrado que el empleo de combinado de la transfección con el rescate de marcadores es un método útil para la titulación de genes, lo cual permite determinar la proporción relativa de varios marcadores genéticos durante la síntesis de DNA fágico.[9]

Ver también

Referencias

  1. 1 2 Iglesias, Juan; Villamonte, Gianfranco; Gonzales, Mauricio (2015). «Transfección de ADN de células de animales». ISSN version en linea 1994-9073. Consultado el 3 de marzo de 2017.
  2. Nota Técnica (15 de julio de 2006). «Transfección». Cultek. Consultado el 3 de marzo de 2017.
  3. Pietrasanta, Lia (2001). «Tópicos en biofisica moleular». Consultado el 3 de marzo de 2017.
  4. Promega Corporation (22 de mayo de 2013), FuGENE® HD Transfection Reagent Video, consultado el 30 de marzo de 2017
  5. Iglesias Artola, Juan M. et al. «DNA TRANSFECTION OF ANIMAL CELLS AS A TOOL USED IN ANIMAL BIOTECHNOLOGY». The Biologist.
  6. 1 2 Cortázar, Tania; Walker, John. (2004). «Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania». Consultado el 4 de marzo de 2017.
  7. Lodish, Harvey (2005). «Biologia celular y moleular». Editorial Médica panamericana. Consultado el 4 de marzo de 2017.
  8. Castro, Fidel; Portelles, Yangtse. (1997). «Transfección de ADN a células de mamíferos». Consultado el 4 de marzo de 2017.
  9. Armenta, Valera, Martínez (2006). «Transfección de células por medio de ondas de choque». Consultado el 5 de marzo de 2017.
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